Discussão de Artigo Científico – 17/10/16

DIA: 17/10/2016 (segunda-feira)

LOCAL: Sala de seminários II – Prédio Central – FMRP

HORÁRIO: 11:00 horas

Artigo

Sinalização via receptor de IL-4 do tipo 2 regula a expansão e migração do neutrófilo

 A lesão tecidual, seguida pela colonização por micro-organismos patogênicos, desencadeia processos canônicos de ativação de células estromais e imunológicas que visam orquestrar respostas eficientes que limitem a entrada e colonização do local afetado. Os neutrófilos constituem peça fundamental nessa defesa inicial despendida pelo sistema imunológico contra infecções e são rapidamente mobilizados da circulação para o local infeccionado. Aliado às suas ações efetoras do controle da infecção por fagocitose, degranulação e liberação de NETs, eles liberam diversas citocinas e quimiocinas que irão culminar na eficiente ativação do sistema imune bem como recrutar novas células no combate ao agente estranho.

Não possuindo atividade proliferativa e tendo uma vida muito curta (cerca de 8 horas apenas), a eficiente presença de neutrófilos maduros no foco infeccioso depende da sua rápida geração, proliferação e maturação no ambiente medular, seguido pela sua quimiotaxia até o local infectado. Esse processo é finamente regulado e dependente da citocina G-CSF, que, ao atuar nos progenitores neutrofílicos, estimula sua proliferação, sobrevivência e comprometimento de diferenciação [1]. O principal mecanismo de ação do G-CSF no egresso dos neutrófilos para a circulação se dá por diminuir a expressão de CXCR4, que ao se ligar ao CXCL12 produzido pelas células do ambiente medular mantém o neutrófilo no nicho intramedular, e aumentando a de CXCR2, que promove o egresso dos neutrófilos para a circulação ao seguir o gradiente quimiotático de CXCL1 e CXCL2, produzidos pelas células imunes no ambiente infeccioso.

Curiosamente, pacientes portadores de dermatite atópica com graves infecções de pele por bactérias gram-positivas possuem neutropenía e total ausência de neutrófilos nos locais acometidos [2]. Sendo a doença caracterizada por um perfil de resposta Th2, Woytschak et al. hipotetizaram que, de alguma forma o excesso de citocinas IL-4, IL-5 e IL-13, características da doença, poderiam estar regulando negativamente a geração ou a migração dos neutrófilos para o foco infeccioso [3]. Para isto, inicialmente os autores validaram esse achado clinico no modelo experimental, inoculando subcutaneamente camundongos C57BL/6 com Streptococcus do Grupo A (GAS). Os autores demostraram a presença de comprometimento cutâneo nos animais infectados associados com o marcado infiltrado neutrofílico. De forma interessante, o pre-tratamento com IL-4 em forma de imunocomplexo (IL-4cx, mIL-4 + Anti-IL-4), piorou drasticamente a lesão cutânea associado com a diminuição do influxo de neutrófilos para o local de lesão (6h e 72h após a infeção com GAS) e o incremento do grau de infeção. Em contraparte, o pre-tratamento com anticorpo neutralizando para IL-4 diminui drasticamente o desenvolvimento das lesões, associado com maior influxo de neutrófilos e menor infeção. Similar ao modelo de infeção cutânea, a inoculação intravenosa de Listeria monocytogenes (Lm) em camundongos WT foi associado com marcada neutrofilia dependente da produção da citocina G-CSF, uma vez que o pre-tratamento com anticorpo neutralizando anti-G-CSF evitou a neutrofilia. De forma similar, o pre-tratamento anticorpo neutralizando para IL-4 impediu o influxo de neutrófilos no sangue nos animais infectados, sugerindo o provável papel antagônico da via IL-4 sobre o efeito do G-CSF.

Com o objetivo de estudar a relação antagônica entre a IL-4 e o G-CSF, os autores trataram animais WT com PBS, imunocomplexo G-CSF (G-CSFcx, mG-CSF + anti-G-CSF), IL-4cx ou a combinação deles. Como demostrado, animais tratados com G-CSFcx apresentaram marcada sínteses de neutrófilos na medula óssea e neutrofilia, em contraste com animais tratados com IL-4cx, no entanto, animais tratados com a combinação deles apresentaram marcada redução na produção de neutrófilos. Adicionalmente, no modelo de infeção sistêmica o pre-tratamento com G-CSFcx + IL-4cx levou aumento na bacteremia, perda de peso e desfecho letal dos animais, sugerindo que a via da IL-4 possui um papel antagônico dominante sobre o sinal do G-CSF.

A IL-4 exerce seu papel pleiotrópico através da ligação em dois tipos de receptores (IL-4R do tipo I e do tipo I) os quais sinalizam principalmente via STAT6 [4]. Assim, com o objetivo de estudar os mecanismos associados ao efeito regulador da IL-4 nos neutrófilos, os autores avaliaram a expressão destes receptores em células CD3-CD11b+Ly6G+ (neutrófilos) de animais tratados com PBS, G-CSFcx ou IL-4cx + G-CSFcx. De maneira interessante, o tratamento com G-CSFcx e G-CSFcx+IL-4cx levou ao aumento na expressão do receptor do tipo II (IL-4Rα + IL-13Rα1), fenótipo confirmado pela perdida da fosforilação da pSTAT6 em neutrófilos de animais IIra-/- e II13ra1-/-  tratados in vitro com IL-4. Adicionalmente, em contraste animais WT e II2rg-/- (cadeia γc do receptor IL-4 do tipo I), animais IIra-/-  tratados com IL-4cx+G-CSFcx apresentaram marcado aumento no número de neutrófilos no sangue e no baço assim como total proteção à infeção por Listeria monocytogenes, sugerindo que a IL-4 age no neutrófilo via receptor de IL-4 do tipo II, induzindo a ativação da STAT6 inibindo a expansão dos neutrófilos durante a inflamação e a infeção.

Como previamente descrito, o egresso ou retenção dos neutrófilos da medula óssea assim como a sua migração para o local de infeção/inflamação é controlado pelos receptores de quimiocina CXCR2 e CXCR4 [1]. Portanto, com o objetivo de estudar o possível efeito da IL-4 nos receptores nesse quimiotácticos, os autores avaliaram sua expressão em células CD3-CD11b+Ly6G+ (medula óssea e baço) de animais tratados com PBS, G-CSFcx ou IL-4cx. De forma interessante, em contraste com animais tratado com G-CSFcx, neutrófilos isolados da medula de animais tratados com IL-4cx diminuíram a expressão do receptor CXCR2 associado com o aumento na expressão do receptor CXCR4. Contudo, os autores se perguntaram se o sinal da IL-4 bloquei a capacidade de migração do neutrófilos. Para isto, neutrófilos de animais WT foram tratados in vitro com IL-4 e migração para CXCL2 e CXCL1 foi avaliada. Em concordância com os achados prévios, neutrófilos incubados com IL-4 apresentaram menor capacidade de migração para o gradiente da quimiocina CXCL1 e CXCL2, efeito revertido quando incubados neutrófilos de camundongos II4ra-/-. Este bloqueio in vitro, foi validado in vivo com o modelo de “airpouch” (bolsa de ar), no qual animais contendo cristais de monosódio urato (MSU) ou IL-1β e tratados com IL-4cx apresentaram menor migração de neutrófilos.

A quimiotaxia dos neutrófilos é intracelularmente regulada por dois vias antagônicas: PI3K e a p38 MAPK. Assim, a ligação dos ligantes do receptor CXCR2 leva a ativação da PI3K a qual leva a migração dos neutrófilos. Entretanto, quando no local de inflamação/infeção os neutrófilos via fMLP ou C5a ativam a via das MAPK p38, evitando que o neutrófilo continue migrando para o gradiente de CXCL1/2 [5].  Neste sentido os autores demostraram inicialmente que os neutrófilos isolados do baço e tratados com IL-4 apresentam fosforilação da p38, adicionalmente, neutrófilos pre-tratados com o inibidor da via da p38 (SB203580) e tratados com IL-4 recuperam sua capacidade de migração para o gradiente de CXCL1. Finalmente, na tentativa de transladar estes achados para o modelo in vivo, animais WT foram tratados com PBS, G-CSFcx, IL-4cx + G-CSFcx ou IL-4cx + G-CSFcx + SB203580. Como demostrado, animais tratados com G-CSFcx apresentaram marcada neutrofilia a qual foi revertida pela combinação com IL-4cx, entretanto, animais tratados com G-CSFcx+IL-4cx em combinação com o inibidor da p38 apresentaram influxo de neutrófilos similar aos tratados com G-CSFcx. Desta forma Woytschak et al., demostraram que a IL-4 via p38 regula a sinalização via G-CSF/CXCR2/PI3K inibindo o recrutamento e a migração de neutrófilos.

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Fig. 1. Esquema mostra o efeito da sinalização da IL-4 sobre a migração e o recrutamento dos neutrófilos. (Woytschak et al., 2016)

  1. Eash, K.J., et al., CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J Clin Invest, 2010. 120(7): p. 2423-31.
  2. Boguniewicz, M. and D.Y. Leung, Atopic dermatitis: a disease of altered skin barrier and immune dysregulation. Immunol Rev, 2011. 242(1): p. 233-46.
  3. Woytschak, J., et al., Type 2 Interleukin-4 Receptor Signaling in Neutrophils Antagonizes Their Expansion and Migration during Infection and Inflammation. Immunity, 2016. 45(1): p. 172-84.
  4. LaPorte, S.L., et al., Molecular and structural basis of cytokine receptor pleiotropy in the interleukin-4/13 system. Cell, 2008. 132(2): p. 259-72.
  5. Phillipson, M. and P. Kubes, The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med, 2011. 17(11): p. 1381-90.