Artigo do CRID publicado na Nature Communications

Artigo do CRID publicado na Nature Communications

O estudo “The metabolic function of pyruvate kinase M2 regulates reactive oxygen species production and microbial killing by neutrophils”, com primeira autoria da Dra Juliana Toller, sob supervisão do Prof. Dr. José Carlos Alves-Filho, foi publicado recentemente em um dos mais renomados periódicos do mundo: a Nature Communications.

Parabenizamos todos os envolvidos na construção deste maravilhoso trabalho!

 

A Nature Communications

A Nature Communications é uma revista multidisciplinar de acesso aberto dedicada à publicação de pesquisas de alta qualidade em todas as áreas das ciências biológicas, da saúde, físicas, químicas, da Terra, sociais, matemáticas, aplicadas e de engenharia. Os artigos publicados pela revista visam representar avanços importantes e significativos para os especialistas de cada área.

 

Dra Juliana Toller sobre o desenvolvimento do estudo

“Esse projeto teve início há mais de 6 anos. Eu possuía experiência com neutrófilos, mas nunca tinha trabalhado com metabolismo celular. O Prof. José Carlos sugeriu avaliarmos o papel da PKM2 na função de neutrófilos, pois essa enzima já estava sendo estudada em macrófagos e linfócitos pelo seu grupo de pesquisa. O projeto demorou algum tempo para se estabelecer, pois nossos resultados não condiziam com o que já tinha sido publicado em outros tipos celulares e inicialmente não faziam muito sentido. 

Após muita investigação e discussão da literatura, nós nos deparamos com a via alternativa de produção de DAG a partir da glicose e começamos a desenhar uma nova hipótese para o projeto. Nesse período, tivemos a pandemia, o que atrasou a entrega de reagentes e a realização dos experimentos. Além disso, nosso grupo de pesquisa uniu forças para estudar a Covid-19 e seu impacto na resposta imune, o que também afetou o andamento do projeto. 

Nessa mesma época, fui contemplada com uma bolsa BEPE e fui para a Irlanda, trabalhar com o grupo de pesquisa do Prof. Luke O’Neil, pesquisador que é referência na área de imunometabolismo. Essa colaboração nos possibilitou finalizar os experimentos que faltavam e submetermos o artigo para a publicação. Entre idas e vindas, vários experimentos foram realizados tanto no Brasil quanto na Irlanda para responder os revisores. Foi com imensa alegria que recebemos o aceite na Nature Communications! 

Para mim, o aprendizado que ficou é de que é preciso ter resiliência diante às adversidades, porque muita coisa que você não espera acontece, tanto no nível profissional quanto pessoal. Além disso, ninguém faz ciência sozinho. Discuta seus resultados e protocolos, compartilhe seus erros e acertos, não tenha medo de pedir ajuda. Esse trabalho foi fruto de muita colaboração, cada pessoa que está no artigo foi essencial para ele ser concluído, além do suporte da família, amigos e supervisores, que é muito importante. Quando comecei meu mestrado, nunca imaginei publicar numa revista como a Nature Communications, e aconteceu. Não tenha medo de sonhar, de brigar pelas suas ideias. No fim, vale a pena.”  

 

As principais contribuições do trabalho

Os neutrófilos constituem a primeira linha de defesa contra os patógenos e dependem principalmente da glicólise para exercerem suas funções, como a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e killing de patógenos. Várias enzimas regulam a glicólise, incluindo a piruvato quinase M2 (PKM2), que converte fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato nas etapas finais da glicólise. Apesar do papel da PKM2 na regulação metabólica e transcrição gênica ter sido descrito em macrófagos e linfócitos, sua função em neutrófilos ainda não tinha sido investigada. Sendo assim, nosso trabalho intitulado The metabolic function of pyruvate kinase M2 regulates reactive oxygen species production and microbial killing by neutrophils, publicado na Nature Communications, investigou o papel da PKM2 na modulação da resposta imune de neutrófilos. 

Primeiro, nós observamos que, diferente de macrófagos e linfócitos, a PKM2 era principalmente expressa em sua forma tetramérica e no citoplasma de neutrófilos ativados com zymosan, indicando que essa enzima tem uma maior participação na glicólise do que na transcrição gênica nessas células. Além disso, neutrófilos deficientes de PKM2 ativados com zymosan produziram menos ROS e tiveram um killing de Staphylococcus aureus deficiente. É bem estabelecido que a glicólise é importante para a produção de ROS em neutrófilos, pois ela alimenta a via da pentose fosfato, aumentando a produção de NADPH, que é essencial para a ativação do complexo NADPH-oxidase e, consequentemente, produção de ROS. Curiosamente, nós não encontramos diferenças na concentração de NADPH em neutrófilos deficientes de PKM2, indicando que o início da via glicolítica não estava comprometido nessas células. 

Utilizando kits bioquímicos e técnicas como tracing de glicose, nós observamos que a concentração de PEP estava aumentada e que a dihidroxiacetona fosfato (DHAP) estava diminuída em neutrófilos deficientes de PKM2. A DHAP é importante para a síntese de novo de diacilglicerol (DAG), mas se o DAG produzido a partir da glicólise é importante para a produção de ROS não era estabelecido. É importante destacar que a via canônica para a produção de DAG ocorre na membrana plasmática e envolve a ativação da enzima fosfolipase C (PLC) para a quebra de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato em DAG, desencadeando uma sucessão de eventos que resultam na produção de ROS. Dessa maneira, nós conduzimos uma série de experimentos e encontramos que, na ausência de PKM2, o PEP acumula. 

Ainda, nós observamos que o PEP inibiu a atividade de uma enzima chamada triose fosfato isomerase (TPI), que é responsável por interconverter DHAP e gliceraldeído-3-fosfato (GAP). A inibição da TPI diminuiu a concentração de DHAP, o precursor de DAG. Além disso, a inibição ou ausência da TPI diminuiu a produção de ROS em neutrófilos ativados com zymosan. 

Sendo assim, nós concluímos que na ausência de PKM2 o PEP acumula e inibe a atividade da TPI, o que diminui a produção de DHAP e consequentemente a síntese de novo de DAG a partir da glicose, o que diminui a produção de ROS e o killing de bactérias pelos neutrófilos. Para investigar se essa diminuição na produção de ROS pelos neutrófilos teria um impacto deletério em uma infecção in vivo, nós utilizamos dois modelos de doença: peritonite e infeção de pele. 

Em ambos os modelos, a ausência de PKM2 diminuiu a eliminação da bactéria Staphylococcus aureus, o que retardou a resolução da infecção. Nosso trabalho contribuiu para o melhor entendimento do papel dos passos finais da glicólise para a produção de ROS em neutrófilos, particularmente o papel da PKM2 em regular a síntese de DHAP e DAG para promover a produção de ROS em neutrófilos. Assim, a PKM2 poderia ser um potencial alvo farmacológico em diversas doenças inflamatórias.

 

Texto por: Dra Juliana Toller e Ingra Oliveira.